目 的：
對于剛接觸HPLC的工作人員來說，在實驗前感覺有很多事情都要同時去做，且思路不是很清晰。現在，就用十個步驟來說明用HPLC測定藥品含量的全過程，供大家參考。
儀 器：
安捷倫1100型HPLC（A、B、C、D四元泵，配200mm的C18柱）
藥 品：
頭孢噻肟鈉（頭孢類無菌原料）
關鍵詞：
HPLC、色譜柱、步驟、流動相、基線、平衡、天平、溶解、校正因子、含量測定

第一步：準備工作???????
拿到樣品，我首先查找該藥品的含量檢測標準，熟悉實驗中用到哪些器具、試劑、工具等。因此，我準備了藥勺、鑷子、容量瓶、燒杯、滴管、移液管等，并領取工作對照品。
登記對照品領用記錄。
在本步驟中應該注意：
1.用到的容量瓶、移液管等均應經計量部門校正合格，并在有效期內使用。
2.我用的對照品是中檢所提供。一般的對照品來源有兩種，一種是來自中檢所，為一級對照品；一種是用中檢所對照品標定原料藥，用此原料藥作為對照品，為二級對照品。

第二步：裝色譜柱、沖水
選擇藥品標準中該品種規定的色譜柱（本實驗用200mm的C18柱）接于HPLC，并在儀器A通道上放置新制的超純水。打開HPLC和工作站，儀器自檢完畢后，打開沖洗閥、選擇水的連接通道（A通道）、調節流速至3ml/min，約5-8min后，使原來保存在泵前管路內的流動相被水替換，并排走管路內的氣泡后，關閉沖洗閥；調節流速至0.5ml/min，并保存此時水的方法，開始用水沖洗色譜柱。理論上，20cm色譜柱的沖洗時間大約為30-40min。在本步驟中應該注意：
1.色譜柱在安裝時要注意流向，不要接反。
2.超純水超的制取，我是從超純水機中獲得；還可以用純化水經0.45um的水系膜過濾2遍得到。
3.為防止色譜柱內填料被水沖壞，可添加5%-10%的有機溶劑（乙腈或甲醇）。

第三步： 配制流動相（此時HPLC在沖水）
按照標準規定的流動相配制方法，配制該樣品的流動相。配置流動相用時30-40min。
登記流動相配置記錄。
在本步驟中應該注意:
1.有的HPLC帶有真空脫氣裝置，如安捷倫1100。但也有的儀器沒有，如島津的一些型號，所以在流動相進液相色譜儀前一定要排好氣泡。最簡單的方法就是超聲，一般超聲10-15min即可。
2.如果標準方法規定流動相為有機系和水系混合物，如本實驗。則流動相在進HPLC前，一定要保證混合均勻，以免在進樣后出現前后兩針保留時間差別很大的現象。

第四步：走基線
1.把流動相放入HPLC托盤，并用封口膜把流動相管道密封于流動相瓶中，以防止流動相中有機系揮發。
2.按標準方法設置流速、波長、單針運行時間等儀器參數，并保存樣品方法、運行方法，平衡系統。
在本步驟中應該注意：
此時水已運行約30-50min，已達到了我們的目的，即把色譜柱內原來的保存液替換為水，以防止原來的保存液和現在的流動相不相容，產生沉淀，損害色譜柱。
理論上平衡系統的時間大約為40min，或以基線是否平穩來判斷。
延伸：
在設置方法時，我們要去編輯該藥品的方法或直接調用該方法。這里存在一個儀器使用權限的問題。按照cGMP的要求，應該符合3級管理權限，即維護人員權限、管理員權限、操作員權限（有的地方可能介紹的是4級或5級分類，我們要學習的是這種管理儀器的理念。如果有高手清楚可以賜教，在此先感謝！）。操作人員只有調取方法的權限，是沒有更改或新建方法方法權限的。儀器管理員有分配操作人員調用方法和更改不適用方法的權限。但我們在液相上還很難做到這一點。但在我們新購入的TOC（總有機碳）測定儀上就實現了這個權限的分配。

第五步：稱量（此時的HPLC在走基線）
首先按照稱樣量的大小選擇合適的砝碼校正天平，然后開始正式稱量。此過程用時15-20min。
登記天平使用記錄。
在本步驟中應該注意：
1.稱取的樣品分別為系統適應性樣品（對照品+雜質或對照品加速實驗得到）、對照品、樣品等；可以使用減量法或直接稱量法稱取；稱量的范圍應按照藥典規定的精密稱量標準。
2.稱量完畢，天平歸零、打印出稱量數據并清理天平周圍的衛生。
延伸：
在稱量過程中，樣品暴露于空中，噻肟藥粉會漂浮在空氣中，這是過敏源。因此，這一步的操作應該是在密封的層流罩內進行。但我們還沒有做到，因為國內還沒有廠家能做出在層流罩下使用十萬分子一電子天平的這套裝置。（這一點不知道國外是怎么做的？如果有高手知道可以賜教，在此先感謝！）

第六步：樣品溶解（此時的HPLC在走基線）
用燒杯盛裝標準方法規定的溶劑，溶解樣品。本實驗用的是水，我直接從超純水機獲取。本過程用時20-30min。
在本步驟中應該注意：
正確使用移液管，并按要求定容。如果標準方法規定，配好的樣品應立即進樣或保存在一定溫度下，則應該嚴格按要求操作。
按照上一步末尾提出的問題，此步驟仍然要在密封的層流罩內進行，以防止過敏源的擴散。

第七步：設置工作站樣品表（此時的HPLC在走基線）
在樣品表中設置每個樣品在樣品盤中的位置、樣品批號、進樣針數、稱樣量，并調用已設置好的樣品方法到樣品表。
在設置樣品最后一針后，調入水（A通道，方法為：0.5ml/min、運行60min）和乙腈（B通道，方法為：0.5ml/min、運行120min）的方法，目的是進樣完畢后先用水沖洗色譜柱內的流動相，后用乙腈保存色譜柱。保存樣品表。

第八步：放樣
把容量瓶中的供試液和對照液分別裝入樣品瓶，按已編制樣品表中的順序放入樣品盤。

第九步：進樣
選擇合適的報告儲存路徑并判斷基線穩定后，點擊開始進樣。
在本步驟中應該注意：
此時進樣，流動相已運行約50min，系統也已平衡。如果運行前看到基線不穩，說明系統還未平衡，還需繼續運行流動相。
進樣后，有關液相操作的工作就完成了，剩下的是進樣完畢后打印圖譜。

第十步：處理剩余樣品、打印圖譜、計算含量
整個實驗完成后，把用過的玻璃器具歸到待清洗區域。進樣完畢，打印色譜圖，計算含量，整理好實驗記錄后，把記錄交于下個檢驗工序的化驗員。
在此過程應該注意：
1.由對照品圖譜主峰面積（5針）計算出校正因子的平均值和RSD（相對標準偏差），藥典中的要求是小于2%，我們內部控制為小于0.5%。根據樣品圖譜主峰面積，把校正因子和水分帶入公式，即可計算含量。
2.如果記錄上填寫數據錯誤，應該用單線或雙線劃掉，在其上方或下方寫下正確的數據，并在旁邊簽字、日期。
3.由于實驗的對象是頭孢類物品，因此，已經溶解而未用盡的樣品應倒入強堿罐內滅活；未用盡得粉末統一回收。
總結：
個人認為按照這十步驟操作HPLC簡單且省時、省力，主要在于：在點擊樣品運行后，我們可以去做其他實驗，這也是自動進樣器的優點；在用水沖洗色譜柱時，配置樣品的流動相；在走基線時，稱量樣品。這樣操作能節省很多時間。在文中提到的時間段，只是我個人在操作過程的記時。實驗過程中，根據個人對實驗熟練的程度，各個步驟的用時會有所變動，但只要順序不變同樣能達到省時、省力的目的。

備注：
1.運行時間計算：
根據方法設置里面單針運行時間、總進針數來判斷。按此試驗：對照品稱取2份，共進5針；樣品稱取7個樣，每個樣2份，各進1針，共14針。樣品單針運行12min，共進5+14=19針，用時為：12×19=228min。
2.流動相配制量計算：
樣品單針運行12min，共進19針，流速為1.2ml/min，那么共消耗的流動相為：12×19×1.2=273.6ml，加上前期平衡系統運行約40min，即40×1.2=48ml，共需要流動相273.6+48=321.6ml。我實際配置1000ml，剩余部分可在下次實驗時繼續用。但應注意，流動相應在有效期內使用。