目的：
對(duì)于剛接觸HPLC的工作人員來說，在實(shí)驗(yàn)前感覺有很多事情都要同時(shí)去做，且思路不是很清晰。現(xiàn)在，就用十個(gè)步驟來說明用HPLC測(cè)定藥品含量的全過程，供大家參考。
儀器：
安捷倫1100型HPLC（A、B、C、D四元泵，配200mm的C18柱）
藥品：
頭孢噻肟鈉（頭孢類無菌原料）
關(guān)鍵詞：
HPLC、色譜柱、步驟、流動(dòng)相、基線、平衡、天平、溶解、校正因子、含量測(cè)定
安捷倫1100型HPLC圖1：
第一步：準(zhǔn)備工作

拿到樣品，我首先查找該藥品的含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，熟悉實(shí)驗(yàn)中用到哪些器具、試劑、工具等。因此，我準(zhǔn)備了藥勺、鑷子、容量瓶、燒杯、滴管、移液管等，并領(lǐng)取工作對(duì)照品。

登記對(duì)照品領(lǐng)用記錄。

在本步驟中應(yīng)該注意：

1.用到的容量瓶、移液管等均應(yīng)經(jīng)計(jì)量部門校正合格，并在有效期內(nèi)使用。

2.我用的對(duì)照品是中檢所提供。一般的對(duì)照品來源有兩種，一種是來自中檢所，為一級(jí)對(duì)照品；一種是用中檢所對(duì)照品標(biāo)定原料藥，用此原料藥作為對(duì)照品，為二級(jí)對(duì)照品。

第二步：裝色譜柱、沖水
選擇藥品標(biāo)準(zhǔn)中該品種規(guī)定的色譜柱（本實(shí)驗(yàn)用200mm的C18柱）接于HPLC，并在儀器A通道上放置新制的超純水。打開HPLC和工作站，儀器自檢完畢后，打開沖洗閥、選擇水的連接通道（A通道）、調(diào)節(jié)流速至3ml/min，約5-8min后，使原來保存在泵前管路內(nèi)的流動(dòng)相被水替換，并排走管路內(nèi)的氣泡后，關(guān)閉沖洗閥；調(diào)節(jié)流速至0.5ml/min，并保存此時(shí)水的方法，開始用水沖洗色譜柱。理論上，20cm色譜柱的沖洗時(shí)間大約為30-40min。在本步驟中應(yīng)該注意：
1.色譜柱在安裝時(shí)要注意流向，不要接反。
2.超純水超的制取，我是從超純水機(jī)中獲得；還可以用純化水經(jīng)0.45um的水系膜過濾2遍得到。
3.為防止色譜柱內(nèi)填料被水沖壞，可添加5%-10%的有機(jī)溶劑（乙腈或甲醇）。

第三步：配制流動(dòng)相（此時(shí)HPLC在沖水）
按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的流動(dòng)相配制方法，配制該樣品的流動(dòng)相。配置流動(dòng)相用時(shí)30-40min。
登記流動(dòng)相配置記錄。
在本步驟中應(yīng)該注意:
1.有的HPLC帶有真空脫氣裝置，如安捷倫1100。但也有的儀器沒有，如島津的一些型號(hào)，所以在流動(dòng)相進(jìn)液相色譜儀前一定要排好氣泡。最簡(jiǎn)單的方法就是超聲，一般超聲10-15min即可。
2.如果標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定流動(dòng)相為有機(jī)系和水系混合物，如本實(shí)驗(yàn)。則流動(dòng)相在進(jìn)HPLC前，一定要保證混合均勻，以免在進(jìn)樣后出現(xiàn)前后兩針保留時(shí)間差別很大的現(xiàn)象。

第四步：走基線
1.把流動(dòng)相放入HPLC托盤，并用封口膜把流動(dòng)相管道密封于流動(dòng)相瓶中，以防止流動(dòng)相中有機(jī)系揮發(fā)。
2.按標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)置流速、波長(zhǎng)、單針運(yùn)行時(shí)間等儀器參數(shù)，并保存樣品方法、運(yùn)行方法，平衡系統(tǒng)。
在本步驟中應(yīng)該注意：
此時(shí)水已運(yùn)行約30-50min，已達(dá)到了我們的目的，即把色譜柱內(nèi)原來的保存液替換為水，以防止原來的保存液和現(xiàn)在的流動(dòng)相不相容，產(chǎn)生沉淀，損害色譜柱。
理論上平衡系統(tǒng)的時(shí)間大約為40min，或以基線是否平穩(wěn)來判斷。
延伸：
在設(shè)置方法時(shí)，我們要去編輯該藥品的方法或直接調(diào)用該方法。這里存在一個(gè)儀器使用權(quán)限的問題。按照cGMP的要求，應(yīng)該符合3級(jí)管理權(quán)限，即維護(hù)人員權(quán)限、管理員權(quán)限、操作員權(quán)限（有的地方可能介紹的是4級(jí)或5級(jí)分類，我們要學(xué)習(xí)的是這種管理儀器的理念。如果有高手清楚可以賜教，在此先感謝！）。操作人員只有調(diào)取方法的權(quán)限，是沒有更改或新建方法方法權(quán)限的。儀器管理員有分配操作人員調(diào)用方法和更改不適用方法的權(quán)限。但我們?cè)谝合嗌线€很難做到這一點(diǎn)。但在我們新購入的TOC（總有機(jī)碳）測(cè)定儀上就實(shí)現(xiàn)了這個(gè)權(quán)限的分配。

第五步：稱量（此時(shí)的HPLC在走基線）
首先按照稱樣量的大小選擇合適的砝碼校正天平，然后開始正式稱量。此過程用時(shí)15-20min。
登記天平使用記錄。
在本步驟中應(yīng)該注意：
1.稱取的樣品分別為系統(tǒng)適應(yīng)性樣品（對(duì)照品+雜質(zhì)或?qū)φ掌芳铀賹?shí)驗(yàn)得到）、對(duì)照品、樣品等；可以使用減量法或直接稱量法稱取；稱量的范圍應(yīng)按照藥典規(guī)定的精密稱量標(biāo)準(zhǔn)。
2.稱量完畢，天平歸零、打印出稱量數(shù)據(jù)并清理天平周圍的衛(wèi)生。
延伸：
在稱量過程中，樣品暴露于空中，噻肟藥粉會(huì)漂浮在空氣中，這是過敏源。因此，這一步的操作應(yīng)該是在密封的層流罩內(nèi)進(jìn)行。但我們還沒有做到，因?yàn)閲鴥?nèi)還沒有廠家能做出在層流罩下使用十萬分子一電子天平的這套裝置。（這一點(diǎn)不知道國外是怎么做的？如果有高手知道可以賜教，在此先感謝！）

第六步：樣品溶解（此時(shí)的HPLC在走基線）
用燒杯盛裝標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的溶劑，溶解樣品。本實(shí)驗(yàn)用的是水，我直接從超純水機(jī)獲取。本過程用時(shí)20-30min。
在本步驟中應(yīng)該注意：
正確使用移液管，并按要求定容。如果標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，配好的樣品應(yīng)立即進(jìn)樣或保存在一定溫度下，則應(yīng)該嚴(yán)格按要求操作。
按照上一步末尾提出的問題，此步驟仍然要在密封的層流罩內(nèi)進(jìn)行，以防止過敏源的擴(kuò)散。

第七步：設(shè)置工作站樣品表（此時(shí)的HPLC在走基線）
在樣品表中設(shè)置每個(gè)樣品在樣品盤中的位置、樣品批號(hào)、進(jìn)樣針數(shù)、稱樣量，并調(diào)用已設(shè)置好的樣品方法到樣品表。
在設(shè)置樣品最后一針后，調(diào)入水（A通道，方法為：0.5ml/min、運(yùn)行60min）和乙腈（B通道，方法為：0.5ml/min、運(yùn)行120min）的方法，目的是進(jìn)樣完畢后先用水沖洗色譜柱內(nèi)的流動(dòng)相，后用乙腈保存色譜柱。
保存樣品表。
第八步：放樣
把容量瓶中的供試液和對(duì)照液分別裝入樣品瓶，按已編制樣品表中的順序放入樣品盤。
第九步：進(jìn)樣
選擇合適的報(bào)告儲(chǔ)存路徑并判斷基線穩(wěn)定后，點(diǎn)擊開始進(jìn)樣。
在本步驟中應(yīng)該注意：
此時(shí)進(jìn)樣，流動(dòng)相已運(yùn)行約50min，系統(tǒng)也已平衡。如果運(yùn)行前看到基線不穩(wěn)，說明系統(tǒng)還未平衡，還需繼續(xù)運(yùn)行流動(dòng)相。
進(jìn)樣后，有關(guān)液相操作的工作就完成了，剩下的是進(jìn)樣完畢后打印圖譜。

第十步：處理剩余樣品、打印圖譜、計(jì)算含量
整個(gè)實(shí)驗(yàn)完成后，把用過的玻璃器具歸到待清洗區(qū)域。進(jìn)樣完畢，打印色譜圖，計(jì)算含量，整理好實(shí)驗(yàn)記錄后，把記錄交于下個(gè)檢驗(yàn)工序的化驗(yàn)員。
在此過程應(yīng)該注意：
1.由對(duì)照品圖譜主峰面積（5針）計(jì)算出校正因子的平均值和RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差），藥典中的要求是小于2%，我們內(nèi)部控制為小于0.5%。根據(jù)樣品圖譜主峰面積，把校正因子和水分帶入公式，即可計(jì)算含量。
2.如果記錄上填寫數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，應(yīng)該用單線或雙線劃掉，在其上方或下方寫下正確的數(shù)據(jù)，并在旁邊簽字、日期。
3.由于實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是頭孢類物品，因此，已經(jīng)溶解而未用盡的樣品應(yīng)倒入強(qiáng)堿罐內(nèi)滅活；未用盡得粉末統(tǒng)一回收。

總結(jié)：
個(gè)人認(rèn)為按照這十步驟操作HPLC簡(jiǎn)單且省時(shí)、省力，主要在于：在點(diǎn)擊樣品運(yùn)行后，我們可以去做其他實(shí)驗(yàn)，這也是自動(dòng)進(jìn)樣器的優(yōu)點(diǎn)；在用水沖洗色譜柱時(shí)，配置樣品的流動(dòng)相；在走基線時(shí)，稱量樣品。這樣操作能節(jié)省很多時(shí)間。在文中提到的時(shí)間段，只是我個(gè)人在操作過程的記時(shí)。實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)個(gè)人對(duì)實(shí)驗(yàn)熟練的程度，各個(gè)步驟的用時(shí)會(huì)有所變動(dòng)，但只要順序不變同樣能達(dá)到省時(shí)、省力的目的。
備注：
1.運(yùn)行時(shí)間計(jì)算：
根據(jù)方法設(shè)置里面單針運(yùn)行時(shí)間、總進(jìn)針數(shù)來判斷。按此試驗(yàn)：對(duì)照品稱取2份，共進(jìn)5針；樣品稱取7個(gè)樣，每個(gè)樣2份，各進(jìn)1針，共14針。樣品單針運(yùn)行12min，共進(jìn)5+14=19針，用時(shí)為：12×19=228min。
2.流動(dòng)相配制量計(jì)算：
樣品單針運(yùn)行12min，共進(jìn)19針，流速為1.2ml/min，那么共消耗的流動(dòng)相為：12×19×1.2=273.6ml，加上前期平衡系統(tǒng)運(yùn)行約40min，即40×1.2=48ml，共需要流動(dòng)相273.6+48=321.6ml。我實(shí)際配置1000ml，剩余部分可在下次實(shí)驗(yàn)時(shí)繼續(xù)用。但應(yīng)注意，流動(dòng)相應(yīng)在有效期內(nèi)使用。